עקרונות ושיטות ניתוח כמותי באמצעות כרומטוגרפיה נוזלית

מנגנון ההפרדה של כרומטוגרפיית נוזלים מבוסס על ההבדל בזיקה של הרכיבים בתערובת לשני השלבים.

על פי השלבים הנייחים השונים, כרומטוגרפיה נוזלית מחולקת לכרומטוגרפיה של נוזל-מוצק, כרומטוגרפיה של נוזל-נוזל וכרומטוגרפיה של פאזה מלוכדת.הכרומטוגרפיה הנפוצה ביותר היא כרומטוגרפיה נוזל-מוצק עם סיליקה ג'ל כחומר מילוי וכרומטוגרפיה של פאזה מלוכדת עם מיקרוסיליקה כמטריצה.

על פי הצורה של שלב נייח, ניתן לחלק כרומטוגרפיה נוזלית לכרומטוגרפיה עמודה, כרומטוגרפיה נייר וכרומטוגרפיה שכבה דקה.על פי יכולת הספיחה, ניתן לחלק אותו לכרומטוגרפיה ספיחה, כרומטוגרפיה מחיצה, כרומטוגרפיה של חילופי יונים וכרומטוגרפיה של חדירת ג'ל.

בשנים האחרונות נוספה מערכת זרימת נוזלים בלחץ גבוה למערכת הכרומטוגרפיה של עמודת הנוזל כדי לגרום לפאזה הניידת לזרום במהירות בלחץ גבוה כדי לשפר את אפקט ההפרדה, ולכן כרומטוגרפיה נוזלית ביעילות גבוהה (המכונה גם בלחץ גבוה). הופיע.

חֵלֶק
01 עקרון ניתוח כמותי של כרומטוגרפיה נוזלית

כדי לכמת על בסיס איכותי, חומרים טהורים נדרשים כסטנדרטים;

כימות כרומטוגרפיית נוזלים היא שיטה כמותית יחסית: כלומר, כמות האנליט בתערובת נאמדת מכמות ידועה של דגימה סטנדרטית טהורה

חֵלֶק
02 בסיס לכימות באמצעות כרומטוגרפיה נוזלית

כמות הרכיב הנמדד (W) פרופורציונלית לערך התגובה (A) (גובה שיא או שטח שיא), W=f×A.

מקדם תיקון כמותי (f): זהו קבוע המידתיות של נוסחת החישוב הכמותי, ומשמעותו הפיזית היא כמות הרכיב הנמדד המיוצג על ידי ערך התגובה ליחידה (שטח שיא).

ניתן לקבל את גורם התיקון הכמותי מהכמות הידועה של המדגם הסטנדרטי וערך התגובה שלו.

מדוד את ערך התגובה של הרכיב הלא ידוע, וניתן לקבל את כמות הרכיב על ידי גורם התיקון הכמותי.

חֵלֶק
03 מונחים נפוצים בניתוח כמותי

דגימה (דגימה): תמיסה המכילה אנליט לניתוח כרומטוגרפי.מחולקים לדגימות סטנדרטיות ולא ידועות.

תקן: מוצר טהור עם ריכוז ידוע.דגימה לא ידועה (לא ידוע): התערובת שיש לבדוק את הריכוז שלה.

משקל דגימה: השקילה המקורית של הדגימה לבדיקה.

דילול: גורם הדילול של המדגם הלא ידוע.

רכיב: השיא הכרומטוגרפי לניתוח כמותי, כלומר האנליט שתכולתו לא ידועה.

כמות הרכיב (כמות): התוכן (או הריכוז) של החומר הנבדק.

שלמות: תהליך חישובי של מדידת שטח השיא של פסגה כרומטוגרפית על ידי מחשב.

עקומת כיול: עקומה ליניארית של תכולת הרכיבים לעומת ערך התגובה, שנקבעה מכמות ידועה של חומר סטנדרטי, המשמשת לקביעת התוכן הלא ידוע של האנליט.

חֵלֶק
04 ניתוח כמותי של כרומטוגרפיה נוזלית

1. בחרו שיטה כרומטוגרפית המתאימה לניתוח כמותי:

l אשר את השיא של הרכיב שזוהה והשיג רזולוציה (R) גדולה מ-1.5

l קבע את העקביות (הטוהר) של הפסגות הכרומטוגרפיות של הרכיבים שנבדקו

l קבע את מגבלת הגילוי ומגבלת הכימות של השיטה;רגישות וטווח ליניארי

2. קבע עקומת כיול עם דגימות סטנדרטיות בריכוזים שונים

3. בדקו את הדיוק והדיוק של שיטות כמותיות

4. השתמש בתוכנת ניהול הכרומטוגרפיה המתאימה כדי ליישם איסוף דגימות, עיבוד נתונים ותוצאות דיווח

חֵלֶק
05 זיהוי פסגות כמותיות (איכותי)

זהה באופן איכותי כל שיא כרומטוגרפי שיש לכמת

ראשית, השתמש במדגם הסטנדרטי כדי לקבוע את זמן השמירה (Rt) של השיא הכרומטוגרפי שיש לכמת.על ידי השוואת זמן השמירה, מצא את הרכיב המתאים לכל שיא כרומטוגרפי בדגימה הלא ידועה.השיטה האיכותנית הכרומטוגרפית היא להשוות את זמן השמירה עם המדגם הסטנדרטי.הקריטריון לא מספיקאישור נוסף (איכותי)

1. שיטת הוספה סטנדרטית

2. השתמש בשיטות אחרות במקביל: שיטות כרומטוגרפיות אחרות (שנה את המנגנון, כגון: שימוש בעמודות כרומטוגרפיות שונות), גלאים אחרים (PDA: השוואת ספקטרום, חיפוש ספריית ספקטרום; MS: ניתוח ספקטרום מסה, חיפוש ספריית ספקטרום)

3. מכשירים ושיטות אחרים

חֵלֶק
06 אישור של עקביות שיא כמותית

אשר את עקביות השיא הכרומטוגרפית (טוהר)

ודא שיש רק רכיב אחד שנמדד מתחת לכל שיא כרומטוגרפי

בדוק אם יש הפרעות מחומרים נפלטים יחד (זיהומים)

שיטות לאישור של עקביות שיא כרומטוגרפית (טוהר)

השוואת ספקטרוגרמות עם גלאי Photodiode Matrix (PDA).

זיהוי שיא טוהר

2996 תורת זווית הטוהר

שיטות כמותיות הנפוצות ב-PART 07

שיטת עקומה סטנדרטית, מחולקת לשיטת תקן חיצונית ושיטת תקן פנימית:

1. שיטת תקן חיצונית: הכי שימוש בכרומטוגרפיה נוזלית

סדרה של דגימות סטנדרטיות בריכוזים ידועים הוכנה תוך שימוש בדגימות טהורות של התרכובות שייבדקו כדגימות סטנדרטיות.מוזרק לעמוד עד ערך התגובה שלו (שטח שיא).
בטווח מסוים, יש קשר ליניארי טוב בין ריכוז המדגם הסטנדרטי לערך התגובה, כלומר W= f×A , ונוצרת עקומה סטנדרטית.

באותם תנאי ניסוי בדיוק, הזריקו את הדגימה הלא ידועה כדי לקבל את ערך התגובה של הרכיב שיש למדוד.לפי המקדם הידוע f ניתן לקבל את ריכוז הרכיב שיש למדוד.

היתרונות של שיטת התקן החיצוני:פעולה וחישוב פשוטים, זוהי שיטה כמותית נפוצה;אין צורך בכל רכיב להיות מזוהה ולהימחק;נדרש מדגם סטנדרטי;תנאי המדידה של מדגם סטנדרטי ומדגם לא ידוע צריכים להיות עקביים;נפח ההזרקה צריך להיות מדויק.

החסרונות של שיטת התקן החיצוני:תנאי הניסוי נדרשים להיות גבוהים, כגון רגישות הגלאי, קצב הזרימה והרכב הפאזה הניידת לא ניתנים לשינוי;הנפח של כל הזרקה צריך להיות חוזר טוב.

2. שיטת תקן פנימית: מדויק, אבל בעייתי, הכי בשימוש בשיטות סטנדרטיות

כמות ידועה של התקן הפנימי מתווספת לתקן כדי ליצור תקן מעורב, ומכינים סדרה של תקני עבודה בריכוז ידוע.היחס המולארי של תקן לתקן פנימי בתקן המעורב נותר ללא שינוי.להזריק לתוך העמודה הכרומטוגרפית ולקחת (שטח שיא מדגם סטנדרטי / אזור שיא מדגם סטנדרטי פנימי) כערך התגובה.על פי הקשר הליניארי בין ערך התגובה לריכוז תקן העבודה, כלומר W= f×A , נוצרת עקומה סטנדרטית.

כמות ידועה של תקן פנימי מתווספת למדגם הלא ידוע ומוזרקת לעמודה כדי לקבל את ערך התגובה של הרכיב שיש למדוד.לפי המקדם הידוע f ניתן לקבל את ריכוז הרכיב שיש למדוד.

המאפיינים של שיטת התקן הפנימי:במהלך הפעולה מערבבים את הדגימה והתקן הפנימי יחד ומוזרקים לעמוד הכרומטוגרפי, כך שכל עוד היחס בין כמות הרכיב הנמדד לתקן הפנימי בתמיסה המעורבת קבוע, השינוי בנפח הדגימה. לא ישפיע על התוצאות הכמותיות..שיטת התקן הפנימי מקזזת את השפעת נפח הדגימה, ואפילו הפאזה הניידת והגלאי, כך שהיא מדויקת יותר משיטת התקן החיצוני.

חֵלֶק
08 גורמים המשפיעים על תוצאות ניתוח כמותי

דיוק לקוי יכול להיגרם על ידי:

אינטגרציה שגויה של שטח שיא, פירוק דגימה או זיהומים שהוכנסו במהלך הכנת הדגימה, בקבוקון הדגימה לא אטום, הנידוף של דגימה או ממס, הכנת דגימה שגויה, בעיות הזרקת דגימה, הכנה סטנדרטית פנימית שגויה

סיבות אפשריות לדיוק לקוי:

שילוב שיא שגוי, בעיות בהזרקה או בהזרקה, פירוק דגימה או זיהומים שהוכנסו במהלך הכנת הדגימה, בעיות כרומטוגרפיות, תגובת גלאי מושפלת