מאמר זה מלמד אותך כיצד לבחור עמודת כרומטוגרפיה נוזלית

כרומטוגרפיה נוזלית היא השיטה העיקרית לבדיקת תכולת כל רכיב וזיהומים בחומרי גלם, תוצרי ביניים, תכשירים וחומרי אריזה, אך לחומרים רבים אין שיטות סטנדרטיות להסתמך עליהן, ולכן אין מנוס מפיתוח שיטות חדשות. בפיתוח שיטות שלב נוזלי, העמוד הכרומטוגרפי הוא הליבה של כרומטוגרפיית הנוזל, ולכן יש חשיבות מכרעת לאופן בחירת עמודה כרומטוגרפית מתאימה. במאמר זה, המחבר יסביר כיצד לבחור עמודת כרומטוגרפיה נוזלית משלושה היבטים: רעיונות כלליים, שיקולים והיקף יישום.

א.רעיונות כלליים לבחירת עמודות כרומטוגרפיה נוזלית

1. להעריך את התכונות הפיזיקליות והכימיות של האנליט: כגון מבנה כימי, מסיסות, יציבות (כגון האם קל לחמצן/להפחית/להידרוליזה), חומציות ובסיסיות וכו', במיוחד המבנה הכימי הוא המפתח גורם בקביעת המאפיינים, כגון הקבוצה המצומדת יש ספיגה אולטרה סגול חזקה וקרינה חזקה;

2. קבע את מטרת הניתוח: האם נדרשת הפרדה גבוהה, יעילות עמודות גבוהה, זמן ניתוח קצר, רגישות גבוהה, עמידות בלחץ גבוה, חיי עמוד ארוכים, עלות נמוכה וכו';

1. בחר עמודה כרומטוגרפית מתאימה: הבן את ההרכב, התכונות הפיזיקליות והכימיות של חומר המילוי הכרומטוגרפי, כגון גודל החלקיקים, גודל הנקבוביות, סבילות לטמפרטורה, סבילות ל-pH, ספיחה של האנליט וכו'.

1. שיקולים לבחירת עמודות כרומטוגרפיה נוזלית

פרק זה ידון בגורמים שיש לקחת בחשבון בעת ​​בחירת עמודת כרומטוגרפיה מנקודת המבט של התכונות הפיזיקליות והכימיות של עמודת הכרומטוגרפיה עצמה. 2.1 מטריצת מילוי

2.1.1 מטריצת סיליקה ג'ל מטריצת המילוי של רוב עמודות הכרומטוגרפיה הנוזליות היא סיליקה ג'ל. לסוג זה של חומר מילוי יש טוהר גבוה, עלות נמוכה, חוזק מכני גבוה, והוא קל לשינוי קבוצות (כגון קשר פניל, קשר אמינו, קשר ציאנו וכו'), אך ערך ה-pH וטווח הטמפרטורות שהוא סובל מוגבלים: טווח ה-pH של רוב חומרי המילוי למטריצת סיליקה ג'ל הוא 2 עד 8, אך טווח ה-pH של פאזות קשורות סיליקה ג'ל שעברו שינוי מיוחד יכול להיות רחב עד 1.5 עד 10, ויש גם שלבים הקשורים לסיליקה ג'ל שעברו שינוי מיוחד שהם יציבים ב-pH נמוך, כגון Agilent ZORBAX RRHD stablebond-C18, אשר יציב ב-pH 1 עד 8; גבול הטמפרטורה העליון של מטריצת סיליקה ג'ל הוא בדרך כלל 60 ℃, ועמודות כרומטוגרפיה מסוימות יכולות לסבול טמפרטורה של 40 ℃ ב-pH גבוה.

2.1.2 מטריצת פולימר חומרי מילוי פולימרים הם בעיקר פוליסטירן-דיווינילבנזן או פולימתקרילט. היתרונות שלהם הם שהם יכולים לסבול טווח pH רחב - ניתן להשתמש בהם בטווח של 1 עד 14, והם עמידים יותר לטמפרטורות גבוהות (יכול להגיע מעל 80 מעלות צלזיוס). בהשוואה לחומרי מילוי מבוססי סיליקה C18, לסוג זה של חומר מילוי יש הידרופוביות חזקה יותר, והפולימר המאקרו-פורי יעיל מאוד בהפרדת דגימות כמו חלבונים. החסרונות שלו הם שיעילות העמודים נמוכה יותר והחוזק המכני חלש יותר מזה של חומרי מילוי על בסיס סיליקה. 2.2 צורת חלקיקים

רוב חומרי המילוי המודרניים של HPLC הם חלקיקים כדוריים, אך לפעמים הם חלקיקים לא סדירים. חלקיקים כדוריים יכולים לספק לחץ עמודה נמוך יותר, יעילות עמודה גבוהה יותר, יציבות וחיים ארוכים יותר; כאשר משתמשים בפאזות ניידות עם צמיגות גבוהה (כגון חומצה זרחתית) או כאשר תמיסה המדגם היא צמיגה, לחלקיקים לא סדירים יש שטח פנים ספציפי גדול יותר, מה שמתאים יותר לפעולה המלאה של שני השלבים, והמחיר נמוך יחסית. 2.3 גודל חלקיקים

ככל שגודל החלקיקים קטן יותר, כך יעילות העמודה גבוהה יותר וההפרדה גבוהה יותר, אך ההתנגדות ללחץ גבוה גרועה יותר. העמודה הנפוצה ביותר היא העמודה בגודל חלקיקים של 5 מיקרומטר; אם דרישת ההפרדה גבוהה, ניתן לבחור חומר מילוי בגודל 1.5-3 מיקרומטר, אשר תורם לפתרון בעיית ההפרדה של כמה דגימות מטריצות מורכבות ומרובות רכיבים. UPLC יכול להשתמש בחומרי מילוי של 1.5 מיקרומטר; חומרי מילוי בגודל חלקיקים בגודל 10 מיקרומטר או יותר משמשים לעתים קרובות עבור עמודות חצי הכנה או הכנה. 2.4 תכולת פחמן

תכולת הפחמן מתייחסת לשיעור הפאזה המלוכדת על פני השטח של סיליקה ג'ל, הקשורה לשטח פנים ספציפי ולכיסוי השלב המלוכד. תכולת פחמן גבוהה מספקת קיבולת עמודה גבוהה ורזולוציה גבוהה, והיא משמשת לעתים קרובות לדגימות מורכבות הדורשות הפרדה גבוהה, אך בשל זמן האינטראקציה הארוך בין שני השלבים, זמן הניתוח ארוך; לעמודות כרומטוגרפיות עם תכולת פחמן נמוכה יש זמן ניתוח קצר יותר ויכולות להראות סלקטיביות שונות, והן משמשות לעתים קרובות עבור דגימות פשוטות הדורשות ניתוח מהיר ודגימות הדורשות תנאי פאזה מימית גבוהה. בדרך כלל, תכולת הפחמן של C18 נעה בין 7% ל-19%. 2.5 גודל נקבוביות ושטח פנים ספציפי

אמצעי ספיחה של HPLC הם חלקיקים נקבוביים, ורוב האינטראקציות מתרחשות בנקבוביות. לכן, מולקולות חייבות להיכנס לנקבוביות כדי להיספג ולהיפרד.

גודל נקבוביות ושטח פנים ספציפי הם שני מושגים משלימים. גודל נקבוביות קטן פירושו שטח פנים ספציפי גדול, ולהיפך. שטח פנים ספציפי גדול יכול להגביר את האינטראקציה בין מולקולות מדגם ופאזות מלוכדות, לשפר את השמירה, להגדיל את טעינת המדגם ואת קיבולת העמודה, והפרדה של רכיבים מורכבים. חומרי מילוי נקבוביים לחלוטין שייכים לסוג זה של חומרי מילוי. לבעלי דרישות הפרדה גבוהות, מומלץ לבחור בחומרי מילוי בעלי שטח פנים ספציפי גדול; שטח פנים ספציפי קטן יכול להפחית את הלחץ האחורי, לשפר את יעילות העמודה ולהפחית את זמן שיווי המשקל, המתאים לניתוח שיפוע. חומרי מילוי ליבה-קליפה שייכים לסוג זה של חומרי מילוי. בהנחה של הבטחת הפרדה, מומלץ לבחור בחומרי מילוי בעלי שטח פנים ספציפי קטן עבור אלה עם דרישות יעילות אנליזה גבוהות. 2.6 נפח נקבוביות וחוזק מכני

נפח נקבוביות, הידוע גם בשם "נפח נקבוביות", מתייחס לגודל נפח הריק ליחידת חלקיק. זה יכול לשקף היטב את החוזק המכני של חומר המילוי. החוזק המכני של חומרי מילוי בעלי נפח נקבוביות גדול מעט חלש יותר מזה של חומרי מילוי בעלי נפח נקבוביות קטן. חומרי מילוי בעלי נפח נקבוביות קטן או שווה ל-1.5 מ"ל/ג' משמשים בעיקר להפרדת HPLC, בעוד שחומרי מילוי בעלי נפח נקבוביות גדול מ-1.5 מ"ל/ג משמשים בעיקר לכרומטוגרפיה של אי הכללה מולקולרית וכרומטוגרפיה בלחץ נמוך. 2.7 שיעור מכסה

כיסוי יכול להפחית את פסגות הזנב הנגרמות על ידי האינטראקציה בין תרכובות וקבוצות סילאנול חשופות (כגון קשר יוני בין תרכובות אלקליות וקבוצות סילאנול, כוחות ואן דר ואלס וקשרי מימן בין תרכובות חומציות וקבוצות סילאנול), ובכך לשפר את יעילות העמודה וצורת השיא. . פאזות מלוכדות ללא מכסה ייצרו סלקטיביות שונה ביחס לפאזות מלוכדות עם מכסה, במיוחד עבור דגימות קוטביות.

1. היקף יישום של עמודות שונות של כרומטוגרפיה נוזלית

פרק זה יתאר את היקף היישום של סוגים שונים של עמודות כרומטוגרפיה נוזליות דרך מקרים מסוימים.

3.1 עמודה כרומטוגרפית C18 הפוכה

עמודת C18 היא העמודה הפוכה הפוכה ביותר, שיכולה לעמוד במבחני התוכן והטומאה של רוב החומרים האורגניים, והיא ישימה לחומרים בינוניים-קוטביים, קוטביים חלשים ולא-קוטביים. יש לבחור את הסוג והמפרט של העמודה הכרומטוגרפית C18 בהתאם לדרישות ההפרדה הספציפיות. לדוגמה, עבור חומרים עם דרישות הפרדה גבוהות, משתמשים לעתים קרובות במפרטי 5 מיקרומטר*4.6 מ"מ*250 מ"מ; עבור חומרים עם מטריצות הפרדה מורכבות וקוטביות דומה, ניתן להשתמש במפרטים של 4 מיקרומטר*4.6 מ"מ*250 מ"מ או גדלי חלקיקים קטנים יותר. לדוגמה, המחבר השתמש בעמודה של 3 מיקרומטר*4.6 מ"מ*250 מ"מ כדי לזהות שני זיהומים גנוטוקסיים ב- celecoxib API. ההפרדה בין שני החומרים יכולה להגיע ל-2.9, וזה מצוין. בנוסף, תחת הנחת היסוד של הבטחת הפרדה, אם נדרש ניתוח מהיר, נבחר לעתים קרובות עמודה קצרה של 10 מ"מ או 15 מ"מ. לדוגמה, כאשר המחבר השתמש ב-LC-MS/MS כדי לזהות טומאה גנוטוקסית ב-API של piperaquine phosphate, נעשה שימוש בעמודה של 3 מיקרומטר*2.1 מ"מ*100 מ"מ. ההפרדה בין הטומאה למרכיב העיקרי הייתה 2.0, וניתן להשלים את זיהוי הדגימה תוך 5 דקות. 3.2 עמודת פניל ​​הפוכה

עמודת פניל ​​היא גם סוג של עמודת פאזה הפוכה. סוג זה של עמודים הוא בעל סלקטיביות חזקה עבור תרכובות ארומטיות. אם התגובה של תרכובות ארומטיות הנמדדות בעמודת C18 רגילה חלשה, ניתן לשקול להחליף את עמודת הפניל. לדוגמה, כשייצרתי celecoxib API, תגובת הרכיב העיקרי שנמדדה על ידי עמודת הפניל של אותו יצרן ואותו מפרט (כולם 5 מיקרומטר*4.6 מ"מ*250 מ"מ) הייתה בערך פי 7 מזו של עמודת C18. 3.3 טור שלב רגיל

כתוסף יעיל לעמוד שלב הפוך, עמוד שלב רגיל מתאים לתרכובות מאוד קוטביות. אם השיא עדיין מהיר מאוד כאשר נפלטים עם יותר מ-90% פאזה מימית בעמודת הפאזה הפוכה, ואפילו קרוב לשיא הממס וחופף אליו, ניתן לשקול להחליף את העמודה בעלת הפאזה הרגילה. סוג זה של עמודה כולל עמודת היליק, עמודת אמינו, עמודת ציאנו וכו'.

3.3.1 עמודה הילית עמודה הילית בדרך כלל מטמיעה קבוצות הידרופיליות בשרשרת האלקיל המחוברת כדי לשפר את התגובה לחומרים קוטביים. סוג זה של עמודות מתאים לניתוח של חומרי סוכר. המחבר השתמש בסוג זה של עמודות בעת ביצוע התוכן והחומרים הקשורים לקסילוז ונגזרותיו. ניתן להפריד היטב את האיזומרים של נגזרת קסילוז;

3.3.2 עמודת אמינו ועמודת ציאנו עמודת אמינו ועמודת ציאנו מתייחסות להכנסת שינויים אמינו וציאנו בקצה שרשרת האלקיל המחוברת, בהתאמה, כדי לשפר את הסלקטיביות לחומרים מיוחדים: לדוגמה, עמודת אמינו היא בחירה טובה להפרדה של סוכרים, חומצות אמינו, בסיסים ואמידים; לעמוד ציאנו יש סלקטיביות טובה יותר בעת הפרדת חומרים מבניים דומים לא-מומחנים, עקב נוכחותם של קשרים מצומדים. לעתים קרובות ניתן להחליף עמודת אמינו ועמודת ציאנו בין עמודת פאזה רגילה לעמודת פאזה הפוכה, אך לא מומלץ להחליף תכופות. 3.4 טור כירלי

עמוד כיראלי, כשמו כן הוא, מתאים להפרדה וניתוח של תרכובות כיראליות, בעיקר בתחום התרופות. ניתן לשקול סוג זה של עמודות כאשר עמודות שלב הפוך ופאזה רגילה לא יכולות להשיג הפרדה של איזומרים. לדוגמה, המחבר השתמש בעמודה כיראלית של 5 מיקרומטר*4.6 מ"מ*250 מ"מ כדי להפריד בין שני האיזומרים של 1,2-דיפניל-אתילן-דיאמין: (1S, 2S)-1, 2-דיפניל-אתילן-דיאמין ו-(1R, 2R)-1, 2 -diphenylethylenediamine, וההפרדה בין השניים הגיעה לכ-2.0. עם זאת, עמודות כיראליות יקרות יותר מסוגים אחרים של עמודים, בדרך כלל 1W+/חתיכה. אם יש צורך בעמודות כאלה, היחידה צריכה לעשות תקציב מספיק. 3.5 עמודת חילופי יונים

עמודות חילופי יונים מתאימות להפרדה וניתוח של יונים טעונים, כגון יונים, חלבונים, חומצות גרעין וכמה חומרי סוכר. לפי סוג חומר המילוי, הם מחולקים לעמודות חילופי קטונים, עמודות חילופי אניונים ועמודות חילופי קטונים חזקות.

עמודות חילופי קטונים כוללות עמודות על בסיס סידן ומימן, המתאימים בעיקר לניתוח של חומרים קטיוניים כמו חומצות אמינו. לדוגמה, המחבר השתמש בעמודות המבוססות על סידן בעת ​​ניתוח סידן גלוקונאט וסידן אצטט בתמיסת שטיפה. לשני החומרים היו תגובות חזקות ב-λ=210nm, ודרגת ההפרדה הגיעה ל-3.0; המחבר השתמש בעמודות המבוססות על מימן בעת ​​ניתוח חומרים הקשורים לגלוקוז. למספר חומרים קשורים עיקריים - מלטוז, מלטוטריוז ופרוקטוז - הייתה רגישות גבוהה תחת גלאים דיפרנציאליים, עם מגבלת זיהוי נמוכה של 0.5 ppm ודרגת הפרדה של 2.0-2.5.

עמודות חילופי אניונים מתאימות בעיקר לניתוח של חומרים אניונים כמו חומצות אורגניות ויוני הלוגן; לעמודות חילופי קטונים חזקות יש יכולת וסלקטיביות גבוהה יותר של חילופי יונים, והן מתאימות להפרדה וניתוח של דגימות מורכבות.

האמור לעיל הוא רק הקדמה לסוגים וטווחי היישום של מספר עמודות כרומטוגרפיה נוזליות נפוצות בשילוב עם הניסיון של המחבר עצמו. ישנם סוגים מיוחדים נוספים של עמודות כרומטוגרפיות ביישומים בפועל, כגון עמודות כרומטוגרפיות עם נקבוביות גדולות, עמודות כרומטוגרפיות עם נקבוביות קטנות, עמודות כרומטוגרפיה זיקה, עמודות כרומטוגרפיות מולטי-מודות, עמודות כרומטוגרפיה נוזליות עם ביצועים גבוהים במיוחד (UHPLC), עמודות כרומטוגרפיית נוזלים סופר-קריטיים ( SFC) וכו'. הם ממלאים תפקיד חשוב בתחומים שונים. יש לבחור את הסוג הספציפי של העמודה הכרומטוגרפית בהתאם למבנה ומאפייני המדגם, דרישות ההפרדה ומטרות אחרות.