מטאפרוטאומיקה מיקרוביאלית: מעיבוד דגימות, איסוף נתונים ועד ניתוח נתונים

Wu Enhui, Qiao Liang*

המחלקה לכימיה, אוניברסיטת פודן, שנחאי 200433, סין

מיקרואורגניזמים קשורים קשר הדוק למחלות ולבריאות האדם. כיצד להבין את ההרכב של קהילות מיקרוביאליות ותפקידיהן הוא נושא מרכזי שצריך ללמוד בדחיפות. בשנים האחרונות, מטאפרוטאומיקה הפכה לאמצעי טכני חשוב לחקר ההרכב והתפקוד של מיקרואורגניזמים. עם זאת, בשל המורכבות וההטרוגניות הגבוהה של דגימות קהילתיות מיקרוביאליות, עיבוד דגימות, רכישת נתונים בספקטרומטריית המונים וניתוח נתונים הפכו לשלושת האתגרים העיקריים העומדים כיום בפני המטאפרוטאומיקה. בניתוח metaproteomics, לעתים קרובות יש צורך לייעל את הטיפול המקדים של סוגים שונים של דגימות ולאמץ תוכניות הפרדה, העשרה, מיצוי ותמוגה מיקרוביאליים שונים. בדומה לפרוטאום של מין בודד, מצבי רכישת הנתונים של ספקטרומטריית המונים במטאפרוטאומיקה כוללים מצב רכישה תלוית נתונים (DDA) ומצב רכישה בלתי תלויה בנתונים (DIA). מצב רכישת הנתונים של DIA יכול לאסוף לחלוטין את מידע הפפטיד של הדגימה ויש לו פוטנציאל פיתוח גדול. עם זאת, בשל המורכבות של דגימות מטאפרוטאומים, ניתוח נתוני ה-DIA שלו הפך לבעיה מרכזית המעכבת את הסיקור העמוק של מטאפרוטאומיקה. במונחים של ניתוח נתונים, השלב החשוב ביותר הוא בניית מסד נתונים של רצפי חלבונים. לגודל ולשלמות המאגר לא רק השפעה רבה על מספר הזיהויים, אלא גם על הניתוח ברמות המין והתפקוד. נכון להיום, תקן הזהב לבניית מסד נתונים מטאפרוטאומים הוא מאגר רצפי חלבונים המבוסס על המטאנום. יחד עם זאת, שיטת סינון מסדי הנתונים הציבוריים המבוססת על חיפוש איטרטיבי הוכחה כבעלת ערך מעשי חזק. מנקודת המבט של אסטרטגיות ניתוח נתונים ספציפיות, שיטות ניתוח נתונים DIA במרכז פפטיד תפסו זרם מיינסטרים מוחלט. עם הפיתוח של למידה עמוקה ובינה מלאכותית, זה יקדם מאוד את הדיוק, הכיסוי ומהירות הניתוח של ניתוח נתונים מאקרו-פרוטאומי. במונחים של ניתוח ביואינפורמטיקה במורד הזרם, פותחה בשנים האחרונות סדרה של כלי ביאור, שיכולים לבצע ביאור מינים ברמת החלבון, רמת הפפטיד ורמת הגנים כדי לקבל את הרכבן של קהילות מיקרוביאליות. בהשוואה לשיטות אומיקה אחרות, הניתוח הפונקציונלי של קהילות מיקרוביאליות הוא תכונה ייחודית של מקרופרוטאומיקה. Macroproteomics הפכה לחלק חשוב בניתוח מולטי-omics של קהילות מיקרוביאליות, ועדיין יש לה פוטנציאל פיתוח גדול במונחים של עומק כיסוי, רגישות זיהוי ושלמות ניתוח הנתונים.

01טיפול מקדים לדוגמא

נכון לעכשיו, נעשה שימוש נרחב בטכנולוגיית מטאפרוטאומיקה במחקר של מיקרוביום אנושי, אדמה, מזון, אוקיינוס, בוצה פעילה ותחומים אחרים. בהשוואה לניתוח הפרוטאום של מין בודד, טיפול מקדים בדגימה של מטאפרוטאום של דגימות מורכבות עומד בפני אתגרים נוספים. הרכב החיידקים בדגימות בפועל מורכב, טווח השפע הדינמי גדול, מבנה דופן התא של סוגים שונים של מיקרואורגניזמים שונה מאוד, ולעתים קרובות הדגימות מכילות כמות גדולה של חלבוני מארח וזיהומים אחרים. לכן, בניתוח של metaproteome, לעתים קרובות יש צורך לייעל סוגים שונים של דגימות ולאמץ תוכניות הפרדה, העשרה, מיצוי ותמוגה מיקרוביאליים שונים.

למיצוי של מטאפרוטאומים מיקרוביאליים מדגימות שונות יש קווי דמיון מסוימים כמו גם הבדלים מסוימים, אך כיום יש חוסר בתהליך עיבוד מקדים מאוחד לסוגים שונים של דגימות מטאפרוטאומים.

02 רכישת נתונים של ספקטרומטריית מסה

בניתוח פרוטאום רובה ציד, תערובת הפפטידים לאחר טיפול מקדים מופרדת תחילה בעמודה הכרומטוגרפית, ולאחר מכן נכנסת לספקטרומטר המסה לרכישת נתונים לאחר יינון. בדומה לניתוח פרוטאום מינים בודדים, מצבי רכישת הנתונים של ספקטרומטריית מסה בניתוח מקרופרוטאום כוללים מצב DDA ומצב DIA.

עם איטרציה ועדכון מתמשכים של מכשירי ספקטרומטריית מסה, מכשירי ספקטרומטריית מסה בעלי רגישות ורזולוציה גבוהים יותר מוחלים על מטאפרוטאום, וגם עומק הכיסוי של ניתוח מטאפרוטאום משתפר באופן מתמיד. במשך זמן רב, סדרה של מכשירי ספקטרומטריית מסה ברזולוציה גבוהה בראשות Orbitrap הייתה בשימוש נרחב במטאפרוטומה.

טבלה 1 של הטקסט המקורי מציגה כמה מחקרים מייצגים על מטאפרוטאומיקה משנת 2011 ועד היום במונחים של סוג מדגם, אסטרטגיית ניתוח, מכשיר ספקטרומטריית מסה, שיטת רכישה, תוכנת ניתוח ומספר זיהויים.

03 ניתוח נתוני ספקטרומטריית מסה

3.1 אסטרטגיית ניתוח נתונים של DDA

3.1.1 חיפוש במסד נתונים

3.1.2דה נובואסטרטגיית רצף

3.2 אסטרטגיית ניתוח נתונים של DIA

04סיווג מינים וביאור פונקציונלי

הרכב קהילות מיקרוביאליות ברמות טקסונומיות שונות הוא אחד מתחומי המחקר המרכזיים בחקר המיקרוביום. בשנים האחרונות פותחו סדרה של כלי ביאור לביאור מינים ברמת החלבון, רמת הפפטיד ורמת הגנים כדי לקבל את הרכבן של קהילות מיקרוביאליות.

המהות של ביאור פונקציונלי היא להשוות את רצף חלבוני המטרה עם מסד הנתונים של רצף החלבון הפונקציונלי. באמצעות מסדי נתונים של תפקודי גנים כגון GO, COG, KEGG, eggNOG וכו', ניתן לבצע ניתוחי הערות פונקציונליות שונות על חלבונים המזוהים על ידי מקרופרוטאומים. כלי ההערה כוללים את Blast2GO, DAVID, KOBAS וכו'.

05סיכום ואאוטלוק

למיקרואורגניזמים תפקיד חשוב בבריאות האדם ובמחלות. בשנים האחרונות, מטאפרוטאומיקה הפכה לאמצעי טכני חשוב לחקר תפקודן של קהילות מיקרוביאליות. התהליך האנליטי של מטאפרוטאומיקה דומה לזה של פרוטאומיקה חד-מינים, אך בשל המורכבות של אובייקט המחקר של מטאפרוטאומיקה, יש לאמץ אסטרטגיות מחקר ספציפיות בכל שלב ניתוח, מטיפול מקדים מדגימה, רכישת נתונים ועד ניתוח נתונים. נכון לעכשיו, הודות לשיפור שיטות הטיפול המקדים, החידוש המתמשך של טכנולוגיית ספקטרומטריית המונים והפיתוח המהיר של הביואינפורמטיקה, המטאפרוטאומיקה התקדמה מאוד בעומק הזיהוי ובהיקף היישום.

בתהליך של טיפול מקדים בדגימות מקרופרוטאום, יש להתייחס תחילה לאופי הדגימה. כיצד להפריד מיקרואורגניזמים מתאי סביבה וחלבונים הוא אחד האתגרים המרכזיים העומדים בפני מקרופרוטאומים, והאיזון בין יעילות ההפרדה לאובדן חיידקים הוא בעיה דחופה שיש לפתור. שנית, מיצוי החלבון של מיקרואורגניזמים חייב לקחת בחשבון את ההבדלים הנגרמים על ידי ההטרוגניות המבנית של חיידקים שונים. דגימות מאקרופרוטאום בטווח העקבות דורשות גם שיטות טיפול ספציפיות מראש.

במונחים של מכשירי ספקטרומטריית מסה, מכשירי ספקטרומטריית מסה מיינסטרים עברו מעבר מספקטרומטרי מסה המבוססים על מנתחי מסה של Orbitrap כגון LTQ-Orbitrap ו-Q Exactive לספקטרומטרי מסה המבוססים על מנתחי מסה מוצמדים לזמן טיסה של יונים כגון timsTOF Pro . לסדרת המכשירים timsTOF עם מידע ממדי ניידות יונים יש דיוק זיהוי גבוה, מגבלת זיהוי נמוכה וחזרה טובה. הם הפכו בהדרגה למכשירים חשובים במגוון תחומי מחקר הדורשים זיהוי ספקטרומטריית המונים, כגון הפרוטאום, המטאפרוטום והמטבולום של מין בודד. ראוי לציין כי במשך זמן רב, הטווח הדינמי של מכשירי ספקטרומטריית מסה הגביל את עומק כיסוי החלבון של מחקר מטאפרוטאומים. בעתיד, מכשירי ספקטרומטריית מסה עם טווח דינמי גדול יותר יכולים לשפר את הרגישות והדיוק של זיהוי חלבון במטאפרוטאומים.

עבור רכישת נתונים בספקטרומטריית המונים, למרות שמצב רכישת הנתונים של DIA אומץ באופן נרחב בפרוטאום של מין בודד, רוב ניתוחי המקרופרוטאומים העדכניים עדיין משתמשים במצב רכישת הנתונים של DDA. מצב רכישת הנתונים של DIA יכול להשיג באופן מלא את מידע יון המקטע של הדגימה, ובהשוואה למצב רכישת הנתונים של ה-DDA, יש לו פוטנציאל להשיג באופן מלא את המידע הפפטיד של דגימת המקרופרוטאום. עם זאת, בשל המורכבות הגבוהה של נתוני DIA, ניתוח נתוני המקרופרוטאום DIA עדיין מתמודד עם קשיים גדולים. פיתוח של בינה מלאכותית ולמידה עמוקה צפויים לשפר את הדיוק והשלמות של ניתוח נתוני DIA.

בניתוח הנתונים של מטאפרוטאומיקה, אחד השלבים המרכזיים הוא בניית מסד נתונים של רצפי חלבונים. עבור תחומי מחקר פופולריים כגון פלורת מעיים, ניתן להשתמש במאגרי מידע מיקרוביאליים במעיים כגון IGC ו-HMP, והושגו תוצאות זיהוי טובות. עבור רוב הניתוחים המטאפרוטואמיים האחרים, האסטרטגיה היעילה ביותר לבניית מסד נתונים היא עדיין הקמת מסד נתונים רצפי חלבון ספציפי לדגימה המבוססת על נתוני רצף מטאנומי. עבור דגימות קהילתיות מיקרוביאליות עם מורכבות גבוהה וטווח דינמי גדול, יש צורך להגדיל את עומק הרצף כדי להגביר את הזיהוי של מינים בשפע נמוך, ובכך לשפר את הכיסוי של מסד הנתונים של רצף החלבונים. כאשר רצף הנתונים חסר, ניתן להשתמש בשיטת חיפוש איטרטיבית כדי לייעל את מסד הנתונים הציבורי. עם זאת, חיפוש איטרטיבי עשוי להשפיע על בקרת איכות FDR, ולכן יש לבדוק היטב את תוצאות החיפוש. בנוסף, הישימות של מודלים מסורתיים של בקרת איכות FDR בניתוח metaproteomics עדיין שווה לחקור. במונחים של אסטרטגיית חיפוש, אסטרטגיית הספרייה הספקטרלית ההיברידית יכולה לשפר את עומק הכיסוי של מטאפרוטאומיקת DIA. בשנים האחרונות, הספרייה הספקטרלית החזויה שנוצרה על בסיס למידה עמוקה הראתה ביצועים מעולים בפרוטאומיקת DIA. עם זאת, מסדי נתונים של מטאפרוטאומים מכילים לעתים קרובות מיליוני ערכים של חלבון, מה שמביא להיקף גדול של ספריות ספקטרליות חזויות, צורך משאבי מחשוב רבים ומביא למרחב חיפוש גדול. בנוסף, הדמיון בין רצפי חלבונים במטאפרוטומים משתנה מאוד, מה שמקשה להבטיח את הדיוק של מודל חיזוי הספרייה הספקטרלית, כך שספריות ספקטרליות חזויות לא היו בשימוש נרחב במטאפרוטאומיקה. בנוסף, יש לפתח אסטרטגיות חדשות להסקת חלבונים וסיווג ביאור כדי ליישם ניתוח מטאפרוטאומי של חלבונים דומים מאוד לרצף.

לסיכום, כטכנולוגיית מחקר מיקרוביום מתפתחת, טכנולוגיית המטאפרוטאומיקה השיגה תוצאות מחקר משמעותיות ויש לה גם פוטנציאל פיתוח עצום.